工程院食品安全院士团队

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1. 引言

多菌灵（CBZ）是一种有效的农业杀菌剂，但其过度使用导致农药残留在环境和食品中积累，从而对人类健康构成威胁。因此，开发简单、快速和灵敏的检测方法显得尤为重要。电化学传感技术因其快速、简便和高灵敏度而被广泛应用于农药残留检测。电化学传感器的灵敏度主要依赖于电极材料的催化性能。近年来，金属有机框架（MOF）衍生的多孔碳材料因其良好的导电性和高比表面积而受到关注。然而，这些材料的微孔结构限制了金属催化位点的利用率，提高活性位点的暴露率是提升催化活性的关键。

本研究报道了一种通过一步热解策略合成具有大孔壁、集成CoS和CoFe多掺杂纳米颗粒的中空泡沫碳（CoS-FeCo-HSNC）。该方法使用ZnCo-MOF作为牺牲模板，CdS纳米颗粒作为介孔引发剂，铁离子作为开壁大孔引发剂。热解过程中，Zn和Cd挥发形成中空介孔结构，而残余硫促进了CoS的形成。铁离子融合到碳骨架中，将封闭壁转变为开放大孔，形成Fe-N活性位点。这种开放壁结构的分层多孔泡沫碳集成了多种活性成分，提供了高效的电子传递途径和活性位点的局部可达性。最终，将制备的层次化多孔CoS-FeCo-HSNC作为检测蔬菜和水果中CBZ的电化学传感平台。

方案1. 用于检测活鼠伤寒沙门氏菌的AFPAM生物传感器示意图，无需复杂的DNA提取和扩增程序。(A)用于鼠伤寒沙门氏菌检测的AFPAM生物传感器示意图。(B)机器视觉和机器学习介导的图像处理和数据分析。刻度为0.2 mm。

2. 结果与讨论

AFPAM生物传感器用于鼠伤寒沙门氏菌检测的主要证明及表征

本研究开发了一种机器视觉和学习辅助的噬菌体与CbAgo介导的荧光生物传感器，用于检测活的鼠伤寒沙门氏菌。该方法利用羧酸磁性纳米颗粒（MNPs）与噬菌体形成的偶联物，从食物中快速分离活菌。然后使用RIPA裂解缓冲液释放DNA，并通过CbAgo与特定gDNA结合，靶向切割荧光探针，产生荧光信号。荧光探针被富集在链霉亲和素修饰的PS微球上，通过机器视觉算法识别荧光强度，实现检测。这种方法无需复杂的DNA提取和扩增程序，具有高灵敏度和特异性。

荧光信号集成在单个毫米微球的表面，利用链霉亲和素修饰的聚苯乙烯（PS）微球作为荧光信号富集载体。通过将链霉亲和素偶联于羧基PS微球表面，制备了PS0.5 mm-SA和PS1 mm-SA微球。在相同荧光探针浓度下，PS0.5 mm-SA的荧光更强、更集中，因此被选用进行后续实验。PS0.5 mm-SA与生物素化探针结合，形成复合物，在激发光下发出荧光信号。这些信号通过倒置荧光显微镜捕捉，并使用机器视觉算法识别荧光强度，获得相应的信号特征值。

图1. AFPAM生物传感器中CbAgo靶向切割特性验证图及纳米颗粒表征。

基于机器视觉和学习的PS微球信号读出系统原理

本研究的机器视觉和学习算法处理图像的工作流程主要包括两部分：基于机器视觉的荧光信号采集和转换，以及基于机器学习的弹性网络回归模型。通过将荧光信号整合到毫米微球上，消除了传统显微成像的视野损失，提高了检测灵敏度。采用双边滤波和自适应阈值分割算法处理荧光图像，计算平均荧光强度以减少局部异常光点的影响。弹性网络回归模型建立了微球平均荧光强度与鼠伤寒沙门氏菌浓度之间的线性关系，表现出更高的准确性和鲁棒性。这种方法在食品样品中检测鼠伤寒沙门氏菌时不需要复杂的DNA提取和扩增程序。

图2. 基于机器视觉的AFPAM生物传感器PS微球信号读出系统。

AFPAM生物传感器检测鼠伤寒沙门氏菌的灵敏度研究

AFPAM生物传感器在优化条件下检测不同鼠伤寒沙门氏菌浓度的灵敏度进行了评估。荧光信号通过生物素-亲和素相互作用在单个PS0.5 mm-SA微球上富集，随着鼠伤寒沙门氏菌浓度增加，荧光强度呈线性增加（R2 = 0.99）。检测限（LOD）为40.5 CFU/mL，与传统方法相比，AFPAM生物传感器无需DNA扩增，灵敏度提高约15倍。与qPCR方法相比，AFPAM传感器能够区分活菌和非活菌，避免假阳性结果。该方法简化了DNA提取过程，提高了检测效率。

图3. AFPAM生物传感器分析性能图。

AFPAM生物传感器检测鼠伤寒沙门氏菌的特异性研究

AFPAM生物传感器的高特异性是其有效性的关键组成部分。该传感器利用噬菌体LPST10特异性识别活的鼠伤寒沙门氏菌，并通过特定引物与CbAgo蛋白的结合，实现靶向切割荧光探针。实验结果表明，仅鼠伤寒沙门氏菌DNA与引物匹配时才会产生明显的荧光信号，其他致病菌的DNA产生的信号与空白对照几乎一致。这证明了AFPAM传感器的高选择性。

在实际样品检测中，AFPAM传感器能够准确地检测食品样品中的鼠伤寒沙门氏菌，平均回收率在93.22% ~ 106.02%之间。与传统的平板计数法和qPCR法相比，AFPAM传感器的检测结果具有更好的一致性（R2 = 0.96和0.97）。这种方法无需复杂的DNA提取和扩增步骤，仅需3小时即可完成定量检测，灵敏度高于qPCR。然而，AFPAM传感器目前不适合高通量检测，需要进一步改进以适应大规模应用。

图4. 利用AFPAM生物传感器、平板计数法和标准qPCR法对鼠伤寒沙门氏菌的特异性和真实样品进行分析。

3. 总结

本研究设计了一种创新的机器视觉和学习介导的噬菌体与基于CbAgo的AFPAM生物传感器，用于快速、简单和高灵敏度地检测鼠伤寒沙门氏菌。这种方法无需复杂的DNA提取和扩增程序，利用噬菌体特异性鉴定活鼠伤寒沙门氏菌，并通过RIPA裂解缓冲液释放其DNA。CbAgo的独特裂解活性使其能够在gDNA的引导下对双链和单链DNA进行靶向裂解，在室温下具有较高的裂解活性。AFPAM生物传感器采用链霉亲和素修饰的单个聚苯乙烯（PS）微球作为最终测定单元，可以特异性富集生物素化荧光信号探针，从而显著提高灵敏度。这种方法避免了传统PCR方法中的DNA扩增步骤，使其相对于大多数现有荧光传感器具有优势。同时，该方法采用机器视觉算法进行信号处理，将荧光微球的信号值转换为平均荧光强度，消除微球表面异常亮斑的影响。所提出的AFPAM生物传感器成功地提供了准确和高灵敏度的定量食品和环境样品中的鼠伤寒沙门氏菌。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2024.133648

来源：微生物安全与健康网，作者~占英。