原创 | 一文读懂芽孢染色法：揭秘细菌的“休眠密码”
发布时间：2025-04-16 浏览次数：42
在微生物的世界里，细菌的芽孢堪称“生存大师”。当环境恶化时，它们会进入休眠状态，形成厚壁的芽孢，抵抗高温、干旱甚至化学消毒剂的侵袭。如何让这些微小的“防护罩”在显微镜下现形？芽孢染色法正是解开这一谜题的关键技术。本文将从原理到实操，带你全面了解这项微生物学经典技术。
一、芽孢染色法的核心原理
芽孢的特殊结构是其难以被常规染色法观察的原因。芽孢壁由多层致密的蛋白质和钙质组成，透性极低，普通染料难以渗透。芽孢染色法通过以下策略突破这一难题：
1、加热促渗：使用弱碱性染料（如孔雀绿）并加热，促使染料穿透芽孢壁。
2、差异脱色：染色后水洗，菌体中的染料被洗脱，而芽孢因结构致密保留颜色。
3、对比复染：用番红等复染剂对菌体二次染色，最终芽孢呈绿色，菌体呈红色，形成鲜明对比。
注：芽胞具有高度的折光性，外膜致密，渗透性低，故普通染色法不易使其着色，芽胞染色法是根据芽胞既难以着色，而一旦着色又难以脱色的特点设计的。所有芽胞染色法都基于同一个原则：采用着色力强的染料，并加热以促进标本着色，然后使菌体脱色，而芽胞上的染料仍保留，经复染后，菌体和芽胞呈现不同的颜色。
二、实验操作全流程（以Schaeffer-Fulton法为例）
材料准备：枯草芽孢杆菌、5%孔雀绿水溶液、0.5%番红染液、载玻片、酒精灯、显微镜等。
步骤详解：
1、涂片固定：取洁净的载玻片，在载玻片上滴加一滴生理盐水，然后用接种环蘸取少量芽孢菌跟水混匀，晾干，用酒精灯固定。
2、初染加热：将固定好的涂片放入含5%孔雀绿水溶液的50℃水浴染色缸中，浸染15min，如下图2-1。或者在涂片上滴加孔雀绿，酒精灯加热至冒蒸汽并维持5分钟（需补液防干燥），如下图2-2。
3、水洗脱色：取出载玻片，用水冲洗多余染液，直至出水无色为止。
4、复染显色：0.5%碱性番红复染1min。
5、冲洗：用水冲洗多余染液，直至出水无色为止，晾干。
6、镜检观察：先低倍镜找到区域后，换油镜观察芽孢和菌体。菌体呈红色或粉色，而芽孢呈绿色（如下图）。
三、常见问题与注意事项
Q1、为何镜检中游离芽孢多？
答：可能原因：菌体处于生长衰退期，芽孢已释放；培养时间过长导致菌体裂解。
Q2、染色失败怎么办？
答：检查加热是否均匀，避免染液蒸干；确保复染前充分水洗。
&3、关键控制点：
● 无菌操作防污染，试剂现配现用保效果；
● 脱色时间不超过2秒，防止过度脱色。
四、应用场景：从实验室到产业一线
1、食品工业：检测罐头等高温灭菌食品中是否残留耐热芽孢，评估灭菌效果。
2、临床诊断：快速鉴别炭疽芽孢杆菌等致病菌，辅助感染诊断。
3、环境监测：分析土壤或水体中芽孢杆菌的分布，评估生态风险。
4、科研分类：通过芽孢形状（圆形/椭圆形）、位置（中央/末端）等特征进行菌种鉴定。
最后，环凯生物基于芽孢染色技术在微生物检测领域的应用场景，现已整理出相应产品解决方案供选择（见以下列表）！
